Avances en el estudio de ictiotoxinas asociadas con Floraciones Algales Nocivas (FANs)

Las floraciones de microalgas han generado multimillonarias pérdidas económicas a la industria piscícola mundial durante las últimas décadas (Anderson y col., 2000; Hoagland y col., 2002; Imai y col., 2006; Kim, 2010; Park y col., 2013). La mortalidad de peces, tanto en cautiverio como en el ambiente natural, ha sido en muchas ocasiones asociada con el crecimiento explosivo de microalgas tóxicas y/o nocivas, pero también a especies inocuas. Esto se debe a que elevadas biomasas de microalgas pueden producir en su fase terminal de crecimiento una disminución en la concentración de Oxígeno Disuelto (OD) en la columna de agua, producto de la degradación bacteriana, provocando así la muerte de peces y otros organismos por asfixia. Sin embargo, algunas especies de microalgas pueden generar mortalidad de peces en muy bajas concentraciones celulares, evidenciando un directo efecto nocivo a nivel branquial. Dos son los principales mecanismos atribuídos al daño branquial por parte de este selecto grupo de microalgas: (1) daño mecánico de los tejidos debido a la presencia de micro-estructuras punzante y/o cortante, y (2) producción de ictiotoxinas. El estudio de este último mecanismo de acción ha significado un gran desafío científico, debido a que la producción de estos metabolitos ictiotóxicos difiere muchas veces de las ya muy estudiadas ficotoxinas paralizantes, diarreicas, amnésicas y neurotóxicas.

La ictiotoxicidad  de algunas especies microalgales, como Karenia brevis y Karlodinium veneficum, ha sido atribuída ocasionalmente a ficotoxinas como brevetoxinas y karlotoxinas, respectivamente (Baden 1989; Deed y col., 2006; Van Deventer y col., 2012). Sin embargo, un mecanismo que ha sido intensamente estudiado durante los últimos años, relaciona el daño branquial en peces con la producción de ácidos grasos libres (Fossat y col., 1999; Henrikson y col., 2010; Mooney y col., 2011) y especies reactivas de oxígeno (Oda y col., 1997; Marshall y col., 2003) por parte de algunas especies de microalgas. Las especies reactivas de oxígeno (ROS- por su sigla en inglés) tales como los radicales hidroxilos (OH) y superóxido (O₂^-), además del peróxido de hidrógeno (H₂O₂), son producto natural del transporte electrónico durante los procesos metabólicos en células aeróbicas. Así, las ROS son producidas por el fitoplancton durante la respiración y fotosíntesis, siendo significativamente disminuidos usando inhibidores químicos de la fotosíntesis, lo que sugiere que los efectos nocivos a nivel branquial podrían incrementarse durante las horas del día (Marshall y col., 2002). A su vez, los ácidos grasos poli-insaturados tales como ?3 y ?6, son por lo general sólo bio-sintetizados por organismos autótrofos, siendo los ácidos octadecatetraenoico (18:4?3) y docosahexaenoico (DHA, 22:6?3) a menudo los dominantes en dinoflagelados (Dalsgaard y col., 2003). Henrikson y col., (2010) realizaron un importante estudio en este campo en el cual probaron 20 lípidos para determinar sus propiedades ictiotóxicas en larvas de Pimephales promelas. Este estudio concluyó que existe una estrecha relación entre el largo de la cadena de los ácidos grasos y sus propiedades ictiotóxicas, siendo el DHA el ácido graso más tóxico, con una concentración letal media (LC₅₀) de 4,7 +1,3 ?M.

Uso de líneas celulares para el estudio de ictiotoxinas

Las branquias de los peces son un órgano esencial en los sistemas acuáticos, porque aquí ocurren una serie de procesos vitales, tales como, intercambio gaseoso, osmoregulación y difusión iónica, regulación del pH y balance de nitrógeno. Así, las branquias representan un órgano ideal para evaluar el efecto nocivo de diferentes agentes tóxicos o patógenos (Evans y col., 2005).

Existe un amplio registro de los efectos nocivos de diversos compuestos bioactivos producidos por el fitoplancton. Los daños a nivel branquial incluyen necrosis epitelial, pérdida de la lamela secundaria, hipertrofia celular y lisis del epitelio, entre otros (Hiroishi y col., 2005; Deeds y col., 2006). Peces juveniles o estados larvales son comúnmente usados para estudiar los efectos ictiotóxicos causados por microalgas; sin embargo, estas metodologías suelen ser muy problemáticas y costosas debido a que se debe contar con instalaciones especiales para el mantenimiento de los peces, además de requerir grandes volúmenes de cultivos de microalgas. Permisos de ética son requeridos por muchos países para el uso de animales destinados a la experimentación.

Un importante avance para el estudio de los compuestos ictiotóxicos producidos por el fitoplancton fue el desarrollo de un bioensayo in vitro que utiliza como base una línea celular branquial (Dorantes-Aranda y col., 2011; Universidad de Tasmania). El uso de esta técnica ha probado ser una potente herramienta para el estudio de los efectos tóxicos de una amplia variedad de microalgas tanto de cultivos vivos como de sus extractos (Dorantes-Aranda y col., 2015). El uso de líneas celulares tiene la ventaja de permitir un mejor control de las condiciones experimentales, además de reducir el inevitable ruido debido al estrés ocasionado en los peces durante la experimentación (Lee y col., 2009).

Conocimiento de las ictiotoxinas producidas por FANs en Chile

Los efectos nocivos de microalgas productoras de ictiotoxinas en los cultivos de salmones en el sur de Chile han sido ampliamente documentados gracias a la temprana instauración de un programa de monitoreo de fitoplancton en 1988 (Fuica y col., 2008).  Estos eventos han estado asociados principalmente con floraciones de la rafidofícea Heterosigma akashiwo y a los dinoflagelados Karenia selliformis y Alexandrium catenella; sin embargo, a pesar de las grandes pérdidas económicas ocasionadas a la industria salmonicultora durante décadas, el conocimiento acerca de estos fenómenos es casi nulo y se basan principalmente en una relación empírica entre la abundancia de fitoplancton tóxico y la mortalidad de peces.

El primer estudio utilizando microalgas tóxicas provenientes de aguas chilenas para determinar su efecto nocivo a nivel branquial, fue realizado recientemente por nuestro grupo de trabajo del Institute for Marine and Antarctic Studies de la Universidad de Tasmania (Mardones y col., 2015).

Este estudio reveló que el daño branquial en peces (a través de experimentos, usando células branquiales) producido por el dinoflagelado A. catenella no se debe a la presencia de las conocidas toxinas paralizantes (PST), las cuales son de alto riesgo para la salud humana y que frecuentemente producen grandes pérdidas a la industria mitilicultora. Por el contrario, fracciones purificadas de estas toxinas (C1&C2, STX, GTX1&4) mostraron tener un efecto insignificativo en el daño a nivel celular. Sorpresivamente, cepas chilenas de A. catenella resultaron ser importantes productoras de especies reactivas de oxígeno (medidas como radicales superóxido: máx. 8,67 + 0,14 pmol O₂^- cel^-1 h^-1), principalmente, bajo condiciones de estrés celular, y de ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga, como el ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6 ?3; 16–20% del total de ácidos grasos). La síntesis de sub-productos altamente tóxicos (e.g. aldehídos), debido a la acción sinérgica entre los ácidos grasos poli-insaturados y ROS, podrían explicar la alta mortalidad de salmones durante las floraciones de A. catenella en los fiordos chilenos (Fig. 1).

Figura 1. Metabolitos producidos por el dinoflagelado ictiotóxico Alexandrium catenella en los fiordos del sur de Chile y su efecto en el daño branquial de peces, expresado como concentración letal LC₅₀ o porcentaje de disminución de la viabilidad de células branquiales (adaptado de Mardones y col., 2015).

La reciente catástrofe sufrida en los meses de verano de 2016 por la industria salmonicultora en la región de Los Lagos, deja muchas preguntas y un gran desafío para el estudio de las ictiotoxinas producidas por las FANs en nuestro país. El primero y más importante relacionado a este evento, se refiere a la correcta identificación de la microalga causante. Características taxonómicas tales como, tamaño celular, presencia de protuberancias en la superficie celular, forma del núcleo y amplia variabilidad morfológica durante las diferentes etapas de crecimiento, la han clasificado temporalmente como especie perteneciente al género Chattonella o Pseudochattonella. Sin embargo, estudios genéticos aún no han sido realizados para confirmar estas observaciones. Chattonella marina (Hada) Demura & Kawashi ha sido identificada como la microalga con mayor producción de ROS junto con altas concentraciones de ácidos grasos libres (Marshall y col., 2002, 2005; Dorantes-Aranda y col., 2013) , ocasionando por tanto estrés oxidativo en organismos expuestos a FANs creadas por esta especie (Dorantes-Aranda y col., 2015). Debido a que Pseudochattonella pertenece a la clase Dyctyochophyceae, y no es cercanamente asociada con Chattonella spp. (Clase Raphidophyceae) (Edvardsen y col., 2007; Hosoi-Tanabe y col., 2007), su mecanismo ictiotóxico podría ser potencialmente diferente al de Chattonella spp., lo cual representa una importante tarea para futuros estudios en Chile.

Medidas de mitigación de FANs

Previas estrategias utilizadas para mitigar los efectos tóxicos de floraciones algales nocivas (FANs) se habían centrado en la eliminación de células por floculación o la eliminación de la especie causante mediante lisis celular usando tratamientos químicos, ultravioleta y/o ultrasonido. Hoy en día, es sabido que estos enfoques ponen en riesgo la integridad de la membrana plasmática de la microalga, lo que puede potenciar la ictiotoxicidad de estas especies debido a la liberación de las toxinas intracelulares al medio acuático (Deed y col., 2002; Dorantes-Aranda y col., 2015; Mardones y col., 2015).

Una aproximación más promisoria para la mitigación de las FANs es la aplicación de arcillas, las cuales son un constituyente natural de los sedimentos marinos. Exitosamente aplicada por el gobierno de Corea del Sur desde 1996 debido a la recurrente aparición del dinoflagelado ictiotóxico Cochlodinium polykrikoides (Park y col., 2013), investigadores se han centrado en la optimización de la floculación celular comparando la eficiencia de diferentes tipos de arcillas en una amplia variedad de microalgas tóxicas. Estudios posteriores han mostrado que no sólo la microalga, sino que también los compuestos ictiotóxicos extracelulares, pueden ser removidos con la aplicación de las arcillas. Sin embargo, hasta ahora estas propiedades han sido demostradas solo en arcillas de bentonita aplicadas a brevetoxinas (Pierce y col., 2004), microcistinas (Prochazka y col., 2013) e ictiotoxinas derivadas de Prymnesium parvum (Sengco y col., 2005, Seger y col., 2015).

Figura 2. Viabilidad de células branquiales después de 2h de exposición a cultivos de Prymnesium parvum y Karlodinium veneficum y tratados con arcillas de bentonita (0 a 0,25 g/L) (Adaptado de Seger y col., 2015).

Un intensivo estudio acerca del efecto de 14 diferentes tipos de arcilla en una amplia variedad de ictiotoxinas realizado por nuestro laboratorio, reveló que la eficiencia en la remoción de estos compuestos es dependiente específicamente del tipo de arcilla y del pH en el que son aplicadas (Seger, 2015). A específicos niveles de pH, las arcillas de bentonita demostraron extraer completamente el efecto ictiotóxico de las microalgas P. parvum y Karlodinium veneficum en concentraciones de arcilla de sólo 0,1 y 0,25 g L^-1, respectivamente (Fig. 2). Actualmente se está extendiendo exitosamente la aplicación de las arcillas de bentonita a otras especies ictiotóxicas tales como Chattonella marina, Heterosigma akashiwo y Alexandrium catenella (Seger y col., datos sin publicar).

Agradecimientos

Programa de formación de capital humano avanzado Becas Chile de la Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (Conicyt).

Referencias

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