Fagoterapia: alternativa para el control de enfermedades bacterianas

Jaime Romero, PhD; Profesor Asociado, Laboratorio de Biotecnología, Director Unidad de Alimentos INTA, Universidad de Chile

Introducción Los bacteriófagos (fagos) son virus que infectan exclusivamente bacterias y, por lo tanto, son inofensivos para las células del hospedero eucarionte (peces, humanos, plantas). Se estima que los bacteriófagos son la entidad biológica más abundante del planeta, por ejemplo, se pueden encontrar en ambientes acuáticos, 105 fagos por ml (Weinbauer, 2009), con una proporción aproximada de 10 bacteriófagos por cada bacteria.

Dentro de esta abundancia hay también una gran diversidad. Existen bacteriófagos líticos que luego de penetrar una bacteria patógena/objetivo, son capaces de reproducirse en su interior y destruirla a través de lisis. Esto permite liberar una nueva progenie de fagos, constituida por cientos o miles de partículas virales que infectarán más bacterias patógenas/objetivo repitiendo el ciclo lítico. Esto se traduce en una reducción en el número o desaparición de las bacterias patógenas/objetivo, lo que permite el uso de estos virus en aplicaciones biotecnológicas para tratamientos profilácticos y terapéuticos de peces, moluscos y en otras áreas productivas. De esta forma, los bacteriófagos o fagos surgen como una atractiva estrategia de control de patógenos dada su gran capacidad bactericida. Actualmente, los antibióticos son la principal herramienta terapéutica para el control de enfermedades de origen bacteriano. En Chile, son dos antibióticos autorizados los que concentran el mayor volumen utilizado por la industria para el tratamiento de enfermedades bacterianas. Otros cuatro antibióticos han perdido eficacia en la industria salmonicultora, producto de la aparición de bacterias resistentes a estos fármacos. Por esta razón, surge la necesidad urgente de generar nuevas alternativas para el control o tratamiento de infecciones bacterianas. Una de las opciones más promisorias es la aplicación de bacteriófagos como agentes bactericidas. La prevalencia actual de numerosas bacterias resistentes a antibióticos, otorga a los fagos líticos una renovada importancia, debido a que poseen un potencial terapéutico real gracias a que son capaces infectar y matar a su bacteria hospedera, inclusive las resistentes a antibióticos. Dentro de las principales ventajas de los fagos se encuentran: 1) Poseen una alta especificidad; infectando sólo una especie bacteriana, o incluso, una cepa, por lo tanto, evitan efectos no deseados como alterar la microbiota de los peces o del ambiente. 2) Son auto replicables; es decir, se multiplican mientras encuentren la presencia de su bacteria hospedera, lo que podría reducir el número de aplicaciones. En cada ciclo de un bacteriófago lítico, se liberan cientos de partículas virales listas para seguir infectando, por lo cual, se mantienen en el medio mientras persista su bacteria hospedero. Es decir tiene un efecto de auto-dosis. 3) Su inocuidad y seguridad; está ampliamente reportado que los fagos no presentan ningún riesgo para la salud animal y humana, inclusive podrían ser utilizados en hospederos inmuno-deprimidos, a diferencia de lo que ocurre con algunos antibióticos. Los fagos son omnipresentes y continuamente son consumidos en forma involuntaria a través de los alimentos y agua. Debido a esto, se cree que los fagos son inocuos para el hospedero, ya que no se ha reportado ningún efecto no deseado producto de su consumo. 4) Fácil y rápida selección de nuevos fagos; es un proceso relativamente rápido, puede tomar tan sólo algunos días o semanas en obtener fagos con capacidad bactericida sobre una nueva cepa bacteriana, a diferencia, del desarrollo de un nuevo antibiótico, que puede durar años.

Ejemplos de fagoterapia Diversos estudios avalan la alta potencialidad de la fagoterapia como una alternativa a los antibióticos y las vacunas (Ringo, 2014; Romero, 2012). La Tabla 1 muestra una comparación de las propiedades más relevantes de los fagos, respecto a su uso como antibacterianos. Existen más de 100 trabajos publicados sobre la eficacia de los fagos. Algunos de los más interesantes son su uso contra Staphylococcus aureus (incluyendo resistentes a Methicilina, Escherichia coli, Enterococcus faecium (incluyendo resistentes a Vancomycina) (Viertel, 2014), en aplicaciones para infecciones en humanos. Del mismo modo, el uso de bacteriófagos para controlar infecciones en acuicultura también ha sido materia de estudio y revisiones recientes (Richards, 2014). Es muy alentador su uso en esta área, dado que el ambiente acuático genera condiciones naturales que son similares a las de cultivo en laboratorio, donde se trabaja con suspensiones acuosas. No obstante, la investigación realizada en esta área aún es limitada, y los principales trabajos se han dirigido a especies acuícolas de importancia económica para Japón (Nakai, 2002). La tabla 2 resume los principales trabajos realizados en el uso de bacteriófagos para el control de bacterias patógenas en peces y crustáceos. Fagoterapia en Chile Para investigar el potencial uso de fagos para el control de la infección por Vibrio anguillarum y Flavobacterium psychrophilum en salmones, hemos aislado bacteriófagos en diversas muestras y evaluado sus capacidades para reducir la mortalidad en salmones frente a la infección de estas bacterias patógenas de salmónidos. En estos estudios se aislaron y caracterizaron diez bacteriófagos capaces de infectar a Vibrio anguillarum y quince a Flavobacterium psychrophilum. Cuatro de éstos, se probaron por sus capacidades de protección contra la infección de estas cepas patógenas. Para F. psychrophilum en salmónidos, se aplicó de manera individual los fagos 1H y 6H (Figura 2A). Donde la sobrevida se aumentó desde 20% en peces no tratados a 53 y 40% con fagos 6H y 1H, respectivamente (Gráfico 1) Para mayor información, revisar Castillo y col. (2012) en Journal of Fish Diseases. Para V. anguillarum, se evaluó los fagos ALMC y CHOED (Figura 2B), los cuales fueron capaces de disminuir significativamente la mortalidad de salmón Atlántico (Salmo salar) infectado con esta bacteria patógena. El tratamiento con fagos logró aumentar la sobrevida 87 y 100% en peces tratados con los fagos ALMC y CHOED, respectivamente (Gráficos 2 y 3). Para mayor información revisar Higuera (2013) en Aquaculture. A pesar de las limitaciones de estos ensayos, lo importante es que estas experiencias son las primeras que demuestran la efectividad de los fagos y su potencialidad como terapias contra flavobacteriosis y vibriosis. Dado que el fago CHOED fue la más exitosa herramienta para contrarrestar el ataque de Vibrio anguillarum, el genoma del fago CHOED fue recientemente obtenido y publicado por nuestro grupo (Romero, 2014). El examen de la secuencia reveló que la organización del genoma es similar a los fagos de la Superfamila T7 y cuenta con su propia RNA polimerasa. En base a esta experiencia buscamos transformar este conocimiento en herramientas biotecnológicas útiles para el sector acuícola.

Limitaciones de la fagoterapia y respuestas para superarlas En la mayoría de estos trabajos se ha logrado demostrar un efecto de protección contra las bacterias patógenas sobre los peces, principalmente, en el retraso de la infección o disminuir la mortalidad de los éstos. Para que la fagoterapia pueda ser utilizada de manera efectiva se deben superar ciertos aspectos importantes, que se listan a continuación: i.- Resistencia a fagos. Se han descrito diversos sistemas que poseen las bacterias para evitar la infección por parte de los fagos, el principal es el cambio de receptores a los cuales se adhiere el fago para infectar a la bacteria, estos receptores mutan muy fácilmente, por ello se estima que la frecuencia de resistentes es del orden 10-6. La forma de evitar el problema de la alta frecuencia de bacterias resistentes al tratamiento con fagos, es la utilización de una combinación de fagos con diferentes mecanismos de infección, lo que disminuiría la probabilidad de la aparición de resistencia, es decir, si se utiliza sólo un fago la probabilidad de que aparezca una bacteria patógena resistentes es 1 en 106, pero, si se aumenta a dos fagos esta probabilidad disminuye a uno en 1012. ii.- Disponibilidad de bacteriófagos contra las bacterias patógenas. Si bien este factor hace unas décadas se consideraba quizás limitante, actualmente, con los conocimientos disponibles, se ha dilucidado dicho punto. Desde 1990 es ampliamente aceptado que, en general, por cada bacteria en el mar, hay diez partículas virales, y que son responsables de al menos un tercio de las muertes de bacterias marinas (Weinbauer, 2009). Se han descrito diversos fagos contras distintas bacterias patógenas en acuicultura, incluyendo a F. psychrophilum (Castillo, 2012; Higuera, 2013), y han demostrado su efecto bactericida y protector en los peces. iii.- Vías de administración. En los tratamientos de enfermedades, a través de la utilización de fagos, se han utilizado tres vías principalmente, tópica, digestiva e intraperitoneal. En peces ha sido posible administrarlos con los alimentos (Richards, 2014) y se observó que los fagos se disipan rápidamente por el cuerpo, alcanzando la mayoría de los órganos. Una de las grandes ventajas del uso de bacteriófagos, es que pueden ser utilizados de manera profiláctica sin restricciones, ya que si aparece su bacteria target hospedera se reproducirá en ésta, aumentando rápidamente su número y liberando al medio nuevas progenies de fagos que podrán alcanzar y proteger peces de la bacteria patógena, sin afectar el resto de diversidad microbiana.

Referencias Castillo D, Higuera G, Villa M, Middleboe M, Dals- gaard I, Madsen L, Espejo RT. Diversity of Flavobacterium psychrophilum and the potential use of its phages for protection against bacterial cold water disease in sal- monids. J Fish Dis 2012; 35:193-201; Higuera G, Bastías R, Tsertsvadze G, Romero J, Espejo RT. 2013. Recently discovered Vibrio anguillarum phages can protect against experimentally induced vibriosis in Atlantic salmon, Salmo salar. Aquaculture 392–395:128–133. Madhusudana Rao, B., & Lalitha, K. V. (2015). Bacteriophages for aquaculture: Are they beneficial or inimical. Aquaculture, 437, 146–154. doi:10.1016/j.aquaculture.2014.11.039 Nakai, T., & Park, S. C. (2002). Bacteriophage therapy of infectious diseases in aquaculture. Research in Microbiology, 153, 13–18. Ringø, E., Olsen, R. E., Jensen, I., Romero, J., & Lauzon, H. L. (2014). Application of vaccines and dietary supplements in aquaculture: possibilities and challenges. Reviews in Fish Biology and Fisheries. doi:10.1007/s11160-014-9361-y Richards, G. P. (2014). Bacteriophage remediation of bacterial pathogens in aquaculture: a review of the technology, Bacteriophage, 4:4, e975540, Romero J., Feijoo C. G. Navarrete P. (2012). Antibiotics in Aquaculture – Use, Abuse and Alternatives, Health and Environment in Aquaculture, Dr. Edmir Carvalho (Ed.), ISBN: 978-953-51-0497-1. Romero J, Higuera G, Gajardo F, Castillo D, Middleboe M, García K, Ramírez C, Espejo RT. 2014. Complete genome sequence of Vibrio anguillarum phage CHOED successfully used for Phage Therapy in Aquaculture. Genome Announc. 2(4):e00091-14 Viertel, T. M., Ritter, K., & Horz, H.-P. (2014). Viruses versus bacteria-novel approaches to phage therapy as a tool against multidrug-resistant pathogens. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 1–11. doi:10.1093/jac/dku173 Weinbauer,M.G.,Bettarel,Y.,Cattaneo,R.,Luef,B.,Maier,C.,Motegi,C.,Peduzzi,P.,Mari, X., 2009. Viral ecology of organic and inorganic particles in aquatic systems: avenues for further research. Aquat. Microb. Ecol. 57, 321–341. http://dx.doi.org/10.3354/ ame01363.