Ácido Araquidónico/Vitamina E: Una relación nutricional a considerar para mejorar la respuesta inmune y la resistencia al patógeno SRS en juveniles de salmón del Atlántico

1. Introduccion

Una de las formas de asegurar un buen rendimiento productivo en el cultivo de peces, es generando ejemplares con una buena condición de salud. El uso de nutrientes adecuadamente balanceados en la dieta parece ser una aproximación aceptable para permitir a los peces tener una mejor respuesta inmunológica y, en consecuencia, una mayor habilidad para resistir el ataque de ciertos agentes patógenos u otras situaciones de estrés. Si bien el rol de los lípidos, y en particular de los ácidos grasos, sobre la función inmune de los peces ha sido determinado, sus resultados no siempre son concluyentes, puesto que el efecto de ellos depende tanto de las condiciones ambientales, como de la condición genética de los organismos y de la interacción entre los diferentes tipos de ácidos grasos o con otro tipos de nutrientes (Boureau et al., 2008, Montero et al., 1999; Kiron et al., 2004). Es conocido que los lípidos además de ser una excelente fuente de energía y vehículo para las vitaminas liposolubles, son la fuente de ciertos ácidos grasos altamente insaturados (HUFA, por sus siglas en inglés), que actúan como precursores de ciertos productos metabólicos llamados eicosanoides, compuestos que son parte del sistema de defensa de los organismos, cuya función, entre otras, está asociada con el mejoramiento de la respuesta inmune y a la respuesta en algunos procesos inflamatorios. Así, un adecuado balance dietario de ciertos ácidos grasos altamente insaturados puede contribuir a que los peces estén en mejores condiciones para enfrentar los estímulos de estrés a los cuales son sometidos (Lall, 2000). Se ha señalado que, dependiendo del tipo de ácido graso, su concentración y relación entre ellos, la función de los eicosanoides puede tener efectos inmunosupresores o inmnunestimuladores. Así, generalmente dietas ricas en n-6 HUFAs, principalmente en ácido araquidónico (ARA), producen potentes efectos inmunoestimulatorios y proinflamatorios, mientras que dietas con altos niveles de n-3 HUFAs, principalmente en ácido eicosapentaenoico (EPA) producen efectos antiinflamatorios, (Lall, 2000). Aunque también se ha demostrado que un exceso de ARA en la dieta, también puede llegar a tener un efecto inmunosupresor (Bell et al., 1996), dependiendo del balance de EPA y DHA y el nivel de peroxidación que estos ácidos grasos experimenten. Aun así, se podría esperar que la incorporación de ARA en la dieta contribuya a una mejor respuesta inmune en los peces y, por lo tanto, a una mayor resistencia para enfrentar el ataque de ciertos patógenos. Uno de los antioxidantes naturales más utilizados en acuicultura para la protección de los lípidos es la vitamina E. Numerosos estudios demuestran que la suplementación de las dietas con vitamina E favorece un incremento en la concentración de los ácidos grasos altamente insaturados en los tejidos y, consecuentemente, a una disminución en la peroxidación de ellos, existiendo así una alta correlación entre el incremento de los ácidos grasos poliinsaturados y el requerimiento de vitamina E (Kiron et al., 2004). De esta manera el papel central de la vitamina E en la mejora de la respuesta inmune, pasa por la prevención de la peroxidación de los lípidos de las membranas celulares. La relación entre n-3 HUFA y vitamina E sobre la respuesta inmune ha sido estudiado por Puangkaew et al. (2004), Kiron, et al., (2004) y Montero et al. (2004). Aun así, la mayoría de los estudios sobre mejoramiento de la respuesta inmunológica no evalúan el efecto cuando los peces son expuestos a patógenos y tampoco hay estudios que relacionen el incremento de ácidos grasos específicos en la dieta, como el ácido araquidónico, con los requerimientos de vitamina E. No existen antecedentes suficientes que relacionen la incorporación de ARA con niveles de Vitamina E en la dieta para peces de agua dulce, por lo cual, se espera que un incremento de la incorporación de este ácido graso con un adecuado balance en la incorporación de la Vitamina E, podría contribuir a una mayor deposición de este ácido graso, favoreciendo así su función en los procesos en los cuales este ácido graso está involucrado, como un efecto favorable en las repuesta inmunológica y en la respuesta de los peces cuando son sometidos a un patógeno seleccionado.

2. Materiales y métodos 2.1.Obtención y distribución de alevines: Juveniles de salmón del atlántico fueron obtenidos de una piscicultura comercial de la Región de la Araucanía y trasladados a las instalaciones de la Escuela de Acuicultura de la Universidad Católica de Temuco (Figura 1). Los peces fueron mantenidos durante dos semanas en aclimatación con una dieta comercial. Antes del inicio del experimento, los peces fueron distribuidos en 24 estanques de 100 litros cada uno a razón de 85 peces por estanque, con un peso promedio de 6,5 ± 1,07 g, alcanzando una densidad inicial de 5,5 kg/ m3. La temperatura del agua se mantuvo entre 9,9 ± 0,04 ºC, en flujo continuo de 1,5l/h y fotoperiodo de 24 horas luz. 2.2 Dietas experimentales y alimentación : Se formularon y fabricaron 6 dietas experimentales que contenían tres niveles de ácido araquidónico (bajo, medio y alto); y dos niveles de vitamina E en forma de α-tocoferol acetato (bajo y alto), manteniendo constante el nivel de lípidos totales, proteínas totales, energía, así como los demás tipos de ácidos grasos. Las dietas fueron etiquetadas como ARA1/E1 (0,16% ARA/125 mg kg-1), ARA1/E2 (0,18% ARA/ 755 mg kg-1), ARA2/E1 (0,27% ARA/185 mg kg-1), ARA2/E2 (0,29% ARA/729 mg kg-1), ARA3/E1 (0,63% ARA/193 mg kg-1) y ARA3/E2 (0,63% ARA/ 729 mg kg-1). Las dietas fueron formuladas y fabricadas en la planta piloto de alimentos de la Escuela de Acuicultura de la Universidad Católica de Temuco (Figura 1), utilizando una extrusora experimental marca Clextral, modelo B21 y aceitadas mediante un aceitadora al vacío marca Dinissen. Cada dieta fue probada por triplicado durante 12 semanas. La alimentación fue ad libitum y con una frecuencia de 10 raciones diarias distribuidas en 24 horas. Como fuente de ácido araquidónico se utilizó el producto Vevodar®, y como fuente de Vitamina E, el producto Rovimix E-50 adsorbato®, ambos comercializados por la compañía DSM Product Nutrition. El perfil proximal, de ácidos grasos y vitamina E de las dietas fueron analizadas en el laboratorio de Nutrición de peces de la Escuela de Acuicultura en la Universidad Católica de Temuco (Figura 1) y son mostrada en la Tabla 1. 2.3 Parámetros evaluados 2.3.1 Determinación de Lisozima. Ejemplares de juveniles de salmón del atlántico fueron sacrificados para la extracción de sangre total desde la vena caudal, recuperando al menos 100 ul de plasma, mediante centrifugación a 3000 rpm, el que fue almacenado en un tubo Eppendorf en frío, hasta su llegada al laboratorio y conservado a –20 °C, hasta su análisis. La medición se realizó por espectrofotometría a 530 nm. Expresadas como unidades de actividad de lisozima. 2.3.2. Determinación de Fagocitosis y Brote respiratorio. Para las pruebas de superóxido y fagocitosis, se realizó extracción de macrófagos a partir del riñón anterior, el que fue almacenado en placas con medio de cultivo L15, manteniéndolos en frío durante el traslado al laboratorio. La extracción de los macrófagos se realizó de manera inmediata, separándose las células a ser utilizadas para la prueba de NBT, su actividad fue medida a 630 nm y la fagocitosis fue estimada en porcentaje de células activas en cámara de Neubauer.

2.3.3. Test de desafío. Al final del experimento, 18 ejemplares por cada tratamiento (6 peces por estanque) fueron desafiados mediante inyección intraperitoneal, utilizando una cepa de Piscirickettsia salmonis (SRS) como patógeno de salmónidos. Los peces fueron trasladados desde el hatchery de la Universidad Católica de Temuco hasta la Unidad Experimental de Aquadvise de Fundación Chile, en Puerto Montt (Región de Los Lagos, Chile) donde se realizó el desafío.

2.5 Análisis estadísticos. Los resultados de inmunidad fueron analizados estadísticamente utilizando un análisis de varianza bifactorial, previo chequeo de los supuestos teóricos. Un test de Duncan fue utilizado para diferenciar las medias entre los tratamientos. A los datos expresados como porcentajes se les aplicó la transformación arco - seno para lograr homocedasticidad. En los análisis estadísticos se utilizó el software estadístico MS Statistica 10. 3. Resultados 3.5 Inmunidad. De acuerdo con los resultados mostrados en la figura 1, no se encontraron diferencias significativas (P>0.05) en la actividad de la lisozima ni en la actividad fagocítica con ninguna de las dieta examinadas. Sin embargo, con un nivel bajo de ácido araquidónico (0.18%) combinado con un nivel bajo de vitamina E (125 ppm), se generó una baja respuesta inmunitaria medida como actividad de los macrófagos (NBT), siendo significativamente diferente (P<0.05) al efecto que tuvieron las demás dietas, pero cuando el nivel de ácido araquidónico es igualmente bajo (0.16%) pero combinado con un nivel alto de vitamina E (755 ppm) la respuesta de los macrófagos aumentó significativamente (P<0.05). Por otro lado, cuando el nivel de araquidónico en la dieta incrementó a 0,27 y 0,63 % también se alcanzó una mejor respuesta inmunitaria, medida como actividad de los macrófagos (NBT), independiente si el nivel de vitamina E en la dieta es alto o bajo. La mejor respuesta inmunitaria medida como actividad de los macrófagos se alcanzó con 0,63 de ARA en la dieta independientemente de la concentración de vitamina E. 3.6 Test de desafío. Como muestra la figura 2, independientemente del nivel de vitamina E en la dieta, los peces alimentados con dietas que contienen bajas concentraciones de ARA (0.16% o 0.18%), independiente del nivel de vitamina E, alcanzan mortalidades acumuladas entre 56% y 65% cuando son expuestos al patógeno SRS. Sin embargo, en todos los casos donde la concentración de ácido araquidónico en la dieta es de 0.27% o más, la mortalidad acumulada es menor al 50%. Sin embargo, cuando la concentración de ácido araquidónico en la dieta es de 0,29% y la concentración de Vitamina E es de 729 ppm se alcanzan los mejores resultados de sobrevivencia, con un 24%. 4. Discusión

Los resultados obtenidos en el desafío están directamente correlacionados con la respuesta de los macrófagos (NBT) reportado en este experimento. Cuando se combina bajo nivel de ARA con bajo nivel de vitamina E, se observa una baja estimulación de los macrófagos y una mayor mortalidad acumulada (sobre 56%), cuando los peces son expuestas al patógeno SRS. Blazer and Wolke, (1984) encontraron que la función de los linfocitos T y B en trucha arco iris es disminuida bajo regimenes de deficiencias de vitamina E y que el requerimiento puede incrementarse durante la inmunoestimulación, y esto se evidencia en la sensibilidad de los peces sometidos al patógeno Yersinia ruckeri. En este experimento, una baja concentración de ARA y elevado nivel de vitamina E estimula la actividad de los macrófagos, lo cual coincide con lo reportado por Atalah et al. (2011) quién observó que un nivel elevado de Vitamina E combinado con niveles bajos de PUFA propicia una mejor protección contra la oxidación. Sin embargo, esta condición no es suficiente para disminuir la mortalidad acumulada cuando los peces son expuestos al patógeno SRS, no existiendo una correlación entre la elevada actividad de los macrófagos y la resistencia del salmón del atlántico a la exposición del patógeno SRS. Por otra parte, en todos los casos donde la concentración de ácido araquidónico en la dieta es mayor a 0.27% la mortalidad acumulada disminuye considerablemente, independiente del nivel de vitamina E, mientras que el nivel de estimulación de los macrófagos no varió significativamente. De acuerdo con esto, para alcanzar una buena inmunoestimulación y una mejor respuesta al patógeno SRS, es posible mantener el nivel de vitamina E en la dieta en concentraciones bajas (125 mg/kg), siempre que el nivel de ARA alcance niveles superiores a 0.27%. Por el contrario, con bajas concentraciones de ARA en la dieta, se recomiendan mayores concentraciones de vitamina E para una mayor estimulación de los macrófagos, aunque esto no necesariamente se refleje en una mejor respuesta a la exposición al patógeno. Sólo cuando la concentración de ácido araquidónico en la dieta es de 0,29% y la concentración de vitamina E es de 729 ppm, se alcanza un mayor nivel de estimulación de los macrófagos, y los niveles más bajos de mortalidad cuando los peces son expuestos al patógeno SRS.

Agradecimientos. Este trabajo fue parte del proyecto Fondef D0I1033 y se agradece a las empresas Pesquera los Fiordos por el aporte de los peces y DSM Product Nutrition por el aporte desinteresado al desarrollo de la técnica para determinar vitamina E mediante HPLC y la provisión de sus productos. Referencias bibliograficas Atalah E., Hernández Cruz C.M., Ganuza E., Benítez-Santana T., Fernandez-Palacios J.R., Izquierdo M.S (2011) Enhancement of gilthhead seabream (Sparus aurata) larval growth by dietary vitamin E in relation to two different levels of essential fatty acids. Aquaculture Nutrition Bell, J.G., Ashton, I., Secombes, C.J., Weitzel, B.R., Dick, J.R., Sargent, J.R. 1996. Dietary lipid affects phospholipid fatty acid compositions, eicosanoid production and immune function in Atlantic salmon (Salmo salar). Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acids 54 (3), pp. 173-182 Bureau, D.P., K. Hua and A.M. Harris. 2008. The effect of dietary lipid and longchain n-3 PUFA levels on growth, energy utilization, carcass quality and immune function of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Journal of the World Aquaculture Society, 39: 1-21. Kiron, V., Puangkaew, J., Ishizaka, K., Satoh, S. & Watanabe, T. (2004) Antioxidant status and nonspecific immune responses in rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) fed two levels of vitamin E along with three lipid sources. Aquaculture, 234, 361 - 379. Lall, S., (2000). Nutrition and Health of fish In: Cruz -Suárez, L.E., Ricque-Marie, D., Tapia-Salazar, M., Olvera-Novoa, M.A. y Civera-Cerecedo, R., (Eds.). Avances en Nutrición Acuícola V. Memorias del V Simposium Internacional de Nutrición Acuícola. 19-22, Noviembre, 2000. Mérida, Yucatán, Mexico. Montero, D., Marrero, M., Izquierdo, M.S., Robaina, L., Vergara, J.M., Tort, L. 1999. Effect of vitamin E and C dietary supplementation on some immune parameters of gilthead seabream (Sparus aurata) juveniles subjected to crowding stress. Aquaculture 171 (3-4), pp. 269-278 Montero, D., Socorro, J., Tort, L., Caballero, M.J., Robaina, L.E., Vergara, J.M., Izquierdo, M.S. 2004. Glomerulonephritis and immunosuppression associated with dietary essential fatty acid deficiency in gilthead sea bream, Sparus aurata L., juveniles. Journal of Fish Diseases 27 (5), pp. 297-306 Puangkaew, J., Kiron, V., Satoh, S. & Watanabe T. (2005) Antioxidant defense of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in relation to dietary n-3 highly unsaturated fatty acids and vitamin E contents. Comp. Biochem.Physiol. C., 140, 187-196.