Contribución de microorganismos al reemplazo de ingredientes en alimento de salmónidos

Jaime Romero, PhD; Profesor Asociado, Laboratorio de Biotecnología, Director Unidad de Alimentos INTA, Universidad de Chile

Introducción Las leguminosas - incluyendo soya, lupino y arveja -, así como semillas de girasol y canola están entre las principales fuentes de proteína utilizadas en la alimentación de la producción animal terrestre y se necesitan en la acuicultura para reducir la dependencia del limitado suministro de harina de pescado. Sin embargo, los insumos vegetales en general y de la soya en particular, pueden desafiar a la función y la salud del tracto intestinal (Chikwati y col., 2013; Collins y col., 2012). Los salmónidos desarrollaron una inflamación intestinal cuando se alimentan con dietas que contenían harina de soya (SBM) y algunos otros ingredientes vegetales. SBM es agregada en las dietas comerciales para salmónidos, sin embargo, su nivel de incorporación está limitado por la presencia de factores antinutricionales, que pueden afectar el crecimiento en los salmones reduciendo la conversión de alimento y el crecimiento, causando inflamación intestinal a través de la inducción de alteraciones histológicas en la zona distal del intestino (Knudsen y col., 2007). Estas alteraciones son conocidas como enteritis distal y se han reportado, no sólo en salmónidos, sino también en otros peces de interés comercial (Krogdahl y col., 2010; Penn y col., 2010).

Rol de los microorganismos en la modulación de la enteritis Muchos estudios se han realizado induciendo la enteritis a través de la dieta, usando una alta cantidad de insumos vegetales. En varios estudios recientes (Marjara y col., 2013; Chikwati y col., 2013), se ha usado un tratamiento prolongado de estas dietas y como resultado, la evaluación histológica del intestino distal reveló signos de la inflamación a los cinco días, que aumentó progresivamente en intensidad y afectó a más peces al aumentar el tiempo de exposición a SBM. Sahlmann y col., (2013) observó una elevada expresión en los genes relacionados con la inmunidad durante los primeros cinco días de alimentación en base a soya, incluyendo genes relacionados con kB NF y reguladores de células T y la función de las células B. Dado que existen respuestas inflamatorias involucradas en la enteritis, se ha propuesto que algunos microorganismos podrían jugar un rol en la modulación de este fenómeno, ya sea positiva o negativamente. Este es un área activa de investigación como se aprecia en la siguientes párrafos que revisan reportes recientes de la literatura científica. Algunos autores han intentado evaluar las diferencias entre las poblaciones bacterianas presentes en los contenidos intestinales de peces sanos y peces con enteritis. Por ejemplo, Bakke-Mckellep y col., (2007) reportó que las dietas ricas en harina de soya promovían un aumento de las bacterias totales y una mayor diversidad entre las poblaciones bactrianas más asociadas a mucosa intestinal. Más recientemente, Reveco y col.(2014) comparó la microbiota de peces alimentados con harina de pescado (FM) y harina de soya (SBM) reportando que peces alimentados con la misma dieta presentaban similar composición bacteriana. No obstante, los índices de diversidad fueron fuertemente reducidas por la dieta SBM. Además, la dieta SBM mostró una abundancia relativa mayor de bacterias del phylum Firmicutes que la dieta FM. Las especies bacterianas dominantes, en ambas dietas, correspondieron a Lactococcus, Weissella, y Photobacterium, con Lactoctoccus aumentado en el caso de SBM. Coincidentemente, Desai y col. (2012) reportó que dietas basadas en insumos vegetales presentaban una mayor razón Firmicutes:Proteobacteria en su microbiota intestinal en comparación con peces alimentados con insumos marinos. Estos autores concluyen que la población bacteriana intestinal fue altamente afectada por las condiciones de la dieta y podría desempeñar un papel en el desarrollo de la enteritis.

Potencial de ingredientes microbianos para contener la enteritis Dada la relación que componentes microbianos podrían tener en la enteritis y su modulación, se han propuesto algunas intervenciones dietarias que involucran bacterias para el control de los signos de inflamación/enteritis en salmónidos. En nuestro grupo de investigación del INTA, se compararon señales de enteritis a nivel histológico (Knudsen y col., 2007) en salmones alimentados con dieta control, que sólo contenía harina de pescado, versus una dieta experimental rica en soya y, esta misma dieta experimental suplementada con las bacterias lácticas (Navarrete y col., 2013). Los parámetros histológicos se mantuvieron normales en el caso de la dieta control, en cambio, se presentaron alterados en la dieta experimental. La inclusión de bacterias lácticas produjo una reducción en los índices de enteritis. Los resultados mostraron que la inclusión de cepas de bacterias lácticas, se traduce en disminución de la inflamación característica en este tipo de enteropatías. Otros grupos de investigación han revelado que otros componentes microbianos tienden a reducir los parámetros de enteritis en los peces que reciben dieta vegetal suplementada con dichos suplementos. Grammes y col. (2013) probaron varios microorganismos como suplementos dietarios en una dieta de 20% SBM que induce enteritis y evaluaron su capacidad para atenuar los efectos de dicha dieta. Los tratamientos evaluados consistieron en un control negativo, basado en harina de pescado (FM ), un control positivo basado en 20 % SBM , y cuatro dietas experimentales que combinan 20 % SBM , ya sea con una de las tres levaduras Candida (CU), Kluyveromyces (KM), Saccharomyces (SC ) o con la microalga Chlorella (CV). El examen histopatológico del intestino distal mostró que todos los peces alimentados con la SC o dietas SBM desarrollados signos característicos de enteritis, mientras que los alimentados con la FM, CV o CU mostraron un intestino sano. Los peces alimentados con la dieta KM mostró signos intermedios de enteritis. Experiencias como esta revelan el potencial de la intervención dietaria en la modulación de la enteritis y destacan las diferentes respuestas a un microorganismo u otro. Una línea de investigación similar conducida por un grupo noruego ha demostrado que la inclusión en la dieta de una harina microbiana (BM) que contiene principalmente Methylococcus capsulatus puede prevenir la inflamación inducida por SBM (Romarheim y col., 2011). Más recientemente, estos autores profundizaron en identificar las fracciones BM y productos que tienen este efecto beneficioso (Romarheim y col., 2013). Para ello compararon una dieta FM, con una dieta SBM y con SBM suplementada con diferentes fracciones de BM, entre ellas, autolizada BM (AUT), permeado (PER) o retenido (RET) derivados de la filtración del autorizado. El análisis histológico a nivel intestinal reveló que todos los productos, excepto el permeado brindaron protección significativa contra enteritis inducida por SBM.El componente efectivo de los productos de BM estaba presente en el retenido que consistía principalmente de moléculas grandes y componentes insolubles en agua. Los ácidos nucleicos y moléculas solubles pequeña de agua no parecen proporcionar algún efecto protector. Por lo tanto, es posible visualizar que elementos microbianos externos probablemente asociados a pared celular tengan un efecto positivo en reducir la enteritis. Queda aún mucho camino para definir sus mecanismos de acción y lograr así mejoras consistentes que permitan incluir más elementos vegetales en la dieta de salmónidos.

Uso de microorganismos en forma externa - Fermentación Existen procesos industriales que buscan disminuir los factores antinutricionales en los insumos vegetales, especialmente en la soya. Una propuesta alternativa es la degradación de los factores antinutricionales mediante fermentación. Algunos autores han utilizado este método empleando bacterias de colección, por ejemplo, cepas del género Lactobacillus; sin embargo, hasta ahora no se han obtenido resultados que demuestren efectividad en la reducción (Refstie y col., 2005). En otros sistemas productivos como aves y cerdos, la incorporación de enzimas al alimento es una opción, reportándose que la inclusión de enzimas para degradar NSP, puede mejorar el índice de conversión alimentaria. Esta estrategia se ha intentado en salmones, sin embargo, está restringida por la baja temperatura en que viven los salmónidos, que puede limitar la actividad enzimática. En los siguientes párrafos se muestran los avances en el desarrollo de un bioproceso para la degradación de algunos factores antinutricionales de la soya. Este proceso se basa en el uso de bacterias que degradan polisacáridos no almidón y oligosacáridos (rafinosa, estaquiosa, verbascosa), que han sido aisladas y luego seleccionadas en base a sus actividades enzimáticas. Las cepas incluidas en el proceso cuentan con enzimas implicadas en la degradación de alfa-galactosidos y polisacáridos no almidón (NSP). Una mezcla de estas cepas bacterianas se utilizaron para establecer un bioproceso que redujera algunos de los antinutricionales de la soya, especialmente oligosacáridos y NSP. Se comenzó a escala laboratorio (gramos de harina tratada) para establecer las bases del proceso y sus condiciones básicas. Como sustrato se utilizó de harina de soya. Durante la fermentación, las bacterias inoculadas crecen y se van adentrando microscópicamente en la harina. Esto se puede apreciar en la imagen de la Figura 1. Esto sugiere que mientras las bacterias se multiplican, van colonizando las partículas y degradando más material. Este proceso de fermentación con las bacterias propuestas, produjo una reducción en los contenidos de NSP, estaquiosa y rafinosa en la harina de soya. El porcentaje de reducción observado para los diferentes factores antinutricionales fue de un 23,5% para los NSP totales, de un 83% para la estaquiosa y de un 69% para la rafinosa. A esto se suma que la fermentación logra pre-digerir la proteína presente en la harina de soya, incluso presenta una significativa alza (Opazo y col., 2012). La Figura 2 muestra un gel de poliacrilamida para la separación y observación de las proteínas presentes en la soya. Como referencia se incluye un marcador de masa molecular y también se incluyen dos carriles con diferentes tipos de aislados proteicos de soya (SPI 5100 y 5300). Los carriles contiguos contienen cantidades equivalentes de proteína total y corresponden a muestras de harina de soya en diferentes tiempos de fermentación. Se aprecia que bandas de mayor tamaño (cercanas a 118 KDa) van desapareciendo y aparecen bandas más intensas a nivel de 36 KDa, probablemente producto de la digestión por proteasas bacterianas. De esta forma, además de preservar el contenido de proteínas, el proceso de fermentación puede generar una predigestión de la matriz proteica y convertir a la harina de soya en un insumo más asimilable para los peces (Fig. 3). Actualmente, este insumo fermentado se ha probado en salmónidos con buenos resultados en cuanto a rendimiento y reducción de las signos inflamatorios en el intestino de los peces. Dados los antecedentes expuestos, se proyecta que en futuro se contará con alternativas de procesos y con suplementos dietarios que harán posible una mayor inclusión de insumos vegetales en los alimentos para salmónidos.

Referencias Bakke-Mckellep, A. M., Penn, M. H., Salas, P. M., Refstie, S., Sperstad, S., Landsverk, T., … Krogdahl, Å. (2007). Effects of dietary soyabean meal, inulin and oxytetracycline on intestinal microbiota and epithelial cell stress, apoptosis and proliferation in the teleost Atlantic salmon (Salmo salar L. ). Br. J. Nutr., 97, 699–713. Chikwati, E. M., Sahlmann, C., Holm, H., Penn, M. H., Krogdahl, Å., & Bakke, a. M. (2013). Alterations in digestive enzyme activities during the development of diet-induced enteritis in Atlantic salmon, Salmo salar L. Aquaculture, 402-403, 28–37. doi:10.1016/j.aquaculture.2013.03.023 Collins, S. a., Desai, A. R., Mansfield, G. S., Hill, J. E., Van Kessel, A. G., & Drew, M. D. (2012). The effect of increasing inclusion rates of soybean, pea and canola meals and their protein concentrates on the growth of rainbow trout: Concepts in diet formulation and experimental design for ingredient evaluation. Aquaculture, 344-349, 90–99. doi:10.1016/j.aquaculture.2012.02.018 Desai, A. R., Links, M. G., Collins, S. a., Mansfield, G. S., Drew, M. D., Van Kessel, A. G., & Hill, J. E. (2012). Effects of plant-based diets on the distal gut microbiome of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture, 350-353, 134–142. doi:10.1016/j.aquaculture.2012.04.005 Grammes, F., Reveco, F. E., Romarheim, O. H., Landsverk, T., Mydland, L. T., & Øverland, M. (2013). Candida utilis and Chlorella vulgaris counteract intestinal inflammation in Atlantic salmon (Salmo salar L.). PloS One, 8(12), e83213. doi:10.1371/journal.pone.0083213 Knudsen, D., Urán, P., Arnous, A., Koppe, W., & Frøkiaer, H. (2007). Saponin-containing subfractions of soybean molasses induce enteritis in the distal intestine of Atlantic salmon. Journal of agricultural and food chemistry, 55(6), 2261-2267. Krogdahl, Å., Penn, M.H., Thorsen, J., Refstie, S., Bakke, A.M., (2010). Important antinutrients in plant feedstuffs for aquaculture: an update on recent findings regarding responses in salmonids. Aquaculture Research 41, 333–344. Marjara, I. S., Chikwati, E. M., Valen, E. C., Krogdahl, A., & Bakke, A. M. (2012). Transcriptional regulation of IL-17A and other inflammatory markers during the development of soybean meal-induced enteropathy in the distal intestine of Atlantic salmon (Salmo salar L.). Cytokine, 60(1), 186–96. Opazo, R., Ortúzar, F., Navarrete, P., Espejo, R., & Romero, J. (2012). Reduction of soybean meal non-starch polysaccharides and α-galactosides by solid-state fermentation using cellulolytic bacteria obtained from different environments. PloS One, 7(9), e44783. doi:10.1371/journal.pone.0044783 Penn, M., Thorsen, J., Refstie, S., & Bakke, A. M. (2010). Important antinutrients in plant feedstuffs for aquaculture : an update on recent findings regarding responses in salmonids. Aquaculture, 333-344. Refstie, S., Sahlstrfm, S., Brthen, E., Baeverfjord, G., & Krogedal, P. (2005). Lactic acid fermentation eliminates indigestible carbohydrates and antinutritional factors in soybean meal for Atlantic salmon (Salmo salar ). Innovation, 246, 331 – 345. Reveco, F. E., Øverland, M., Romarheim, O. H., & Mydland, L. T. (2014). Intestinal bacterial community structure differs between healthy and inflamed intestines in Atlantic salmon (Salmo salar L.). Aquaculture, 420-421, 262–269. doi:10.1016/j.aquaculture.2013.11.007 Romarheim, O.H., Øverland, M., Mydland, L.T., Skrede, A., Landsverk, T., 2011. Bacteria grown on natural gas prevent soybean meal-induced enteritis in Atlantic salmon. Journal of Nutrition 141, 124–130. Romarheim, O. H., Landsverk, T., Mydland, L. T., Skrede, A., & Øverland, M. (2013). Cell wall fractions from Methylococcus capsulatus prevent soybean meal-induced enteritis in Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture, 402-403(575), 13–18. doi:10.1016/j.aquaculture.2013.03.011 Sahlmann, C., Sutherland, B. J. G., Kortner, T. M., Koop, B. F., Krogdahl, Å., & Bakke, A. M. (2013). Early response of gene expression in the distal intestine of Atlantic salmon (Salmo salar L.) during the development of soybean meal induced enteritis. Fish and Shellfish Immunology, 34(2), 599–609. doi:10.1016/j.fsi.2012.11.031