Serotipo O2 de Yersinia ruckeri en cultivo chileno de salmón Coho (Oncorhynchus kisutch)

Yersinia ruckeri, miembro de la familia Enterobacteriaceae, es el agente etiológico de la enfermedad de la boca roja (ERM del inglés Enteric Red Mouth disease) o yersiniosis, patógeno que afecta, principalmente, a peces salmónidos. Aunque la bacteria se aisló inicialmente de la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) en Idaho (EE.UU.) en los años 50 (Rucker, 1966; Ross y col., 1966), el agente también se ha descrito en otras especies de diversas familias no salmónidas, así como posibles vectores y otras fuentes ocasionales, incluyendo esturión, rodaballo, carpín dorado, anguila, carpa común, gaviotas, abadejo, rata de agua, entre otros (Bastardo y col., 2011a).

Desde su primera descripción en la década de los 50, esta bacteria ha sido causante de constantes pérdidas económicas en la industria salmonicultora mundial. De hecho, después del primer reporte, la bacteria comenzó a identificarse en países distintos a Estados Unidos, atribuyéndose la aparición de yersiniosis en nuevas áreas geográficas a la importación de peces portadores. Sin embargo, no se puede descartar que el reconocimiento del microorganismo en otros hospedadores y áreas geográficas se debe, en parte, al incremento de la vigilancia y la mejora de los métodos para su detección, a la vez que puede estar relacionado con el incremento de nuevas instalaciones acuícolas en todo el mundo. De esta forma, Y. ruckeri se encuentra distribuida ampliamente en poblaciones y cultivos de peces en Norte y Sudamérica, Sudáfrica, Australia y Europa (ver revisiones Tobback y col., 2007; Kumar y col., 2015).

La enfermedad se evidencia comúnmente en los peces infectados por el típico enrojecimiento de la boca, característica que dio el nombre a esta enfermedad, pero no siempre es evidente, por lo que la aparición de hemorragias en la superficie del cuerpo, alrededor de los opérculos, la base de las aletas y en los principales órganos internos son signos clínicos asociados a Y. ruckeri. Internamente, los peces presentan hemorragia en la superficie del hígado, páncreas, ciegos pilóricos y vejiga natatoria, mientras que el bazo se observa agrandado y ennegrecido y el intestino con cúmulo de líquido amarillento (Bastardo y col., 2011a).

En general, los brotes de yersiniosis comienzan usualmente con bajas mortalidades que lentamente aumentan y pueden llegar a causar pérdidas entre 30 a 70%, siempre que no se realice terapia antimicrobiana. No obstante, la severidad de la yersiniosis está determinada, principalmente, por la virulencia del aislado de Y. ruckeri responsable de la infección, así como el grado de estrés ambiental, específicamente, el aumento de la temperatura (>20 °C) y la salinidad (<20‰) del agua (Altinok y col., 2001; Altinok, 2004).

A diferencia de lo que ocurre con otras bacterias patógenas, la yersiniosis puede ser prevenida de manera eficaz mediante la vacunación. De hecho, esta enfermedad fue la primera frente a la cual se desarrolló una vacuna para peces, la cual se registró en 1976. Desde entonces, a nivel mundial se han elaborado bacterinas de mucha utilidad para la salmonicultura, proveyendo de buenos niveles de protección, pero debido a que no erradica el agente causal, es que a lo largo de estos casi 40 años se han reportado esporádicamente nuevos brotes, debido a peces portadores bajo condiciones de estrés, problemas asociados directamente con el manejo de los cultivos intensivos de peces, relajación en el proceso de vacunación y, más recientemente, a la aparición de nuevas variantes antigénicas en los aislados de Y. ruckeri que no se encuentran incluidos en las formulaciones comerciales.

La mayoría de las vacunas comerciales contra la yersiniosis está basada sólo en cepas del serotipo O1a, biotipo 1 por ser el causante en la mayoría de los casos y, por lo tanto, la más virulenta. Además, la vacuna monovalente es capaz de generar protección cruzada con las otras serovariedades. Sin embargo, los quiebres inmunitarios ocurridos en los últimos años, han generado la necesidad de desarrollar nuevas vacunas, usando la proteasa de Y. ruckeri Yrp1, el gen aroA, productos extracelulares y lipopolisacáridos (LPS) (ver revisión Kumar y col., 2015). Además, infecciones provocadas por el biotipo 2 han estimulado la formulación de nuevas bacterinas bivalentes que incluyen el biotipo 1 y 2 de Y. ruckeri, mostrando muy buena protección (Deshmukh y col., 2012).

En Chile, el primer aislamiento de Y. ruckeri se realizó a partir infecciones ocurridas en un cultivo de salmón Atlántico (Salmo salar) en 1992 (Troncoso y col., 1994), desarrollándose una vacuna comercial contra la yersiniosis en 1995 (Bravo y Mitdlyng, 2007), la que por más de una década tuvo mucho éxito en la prevención de la infección causada por este patógeno. Sin embargo, en 2008, ocurrieron mortalidades de hasta 10% en salmón Atlántico (2–60 gramos) vacunados con una bacterina bivalente (O1/O2b).

Bastardo y col. (2011b) aislaron mayoritariamente Y. ruckeri O1b/biotipo 1 y asociaron a este grupo las mortalidades, aunque en su estudio también se recuperó un aislado de salmón Atlántico O2b. Hasta el año 2015, los principales reportes de yersiniosis ocurridos en el país habían sido realizados en salmón Atlántico, sin embargo, durante el presente año se produjeron mortalidades de hasta 15% en alevines de salmón coho (Oncorhynchus kisutch) con tamaños entre 1 a 5 gramos y cultivados en dos distintas regiones del país (Biobío y Araucanía).

El presente artículo describe el análisis de estos brotes, en donde tres aislados bacterianos fueron considerados como representantes de las mortalidades. Inicialmente, todos ellos se identificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrito por Bastardo y col. (2012) como pertenecientes a la especie Y. ruckeri y se confirmó por primera vez el serotipo O2b como responsable de las mortalidades de alevines de salmón Coho.

Para todos los experimentos, Y. ruckeri fueron crecidas rutinariamente en el medio tripticasa de soya (TSA) en su versión líquida o incorporando un 0,9% agar bacteriológico (Oxoid) para el medio sólido. El crecimiento de cada Y. ruckeri se realizó a 25 °C durante 48 h. Todos los aislados fueron conservados a –80 °C en crioviales comerciales Cryo-billes (AES laboratoire).

Con el fin de realizar los estudios bioquímicos, antigénicos y genéticos, se incluyó las cepas de Y. ruckeri CECT 955, CECT 956 y CECT 4319T. Todas ellas han sido empleadas como controles en diversos estudios científicos y, más específicamente, en el artículo de Bastardo y col. (2011b). Por lo tanto, los tres aislados obtenidos a partir del riñón de los peces infectados se caracterizaron bioquímicamente usando método convencional de tubo y placa, siguiendo los procedimientos de Romalde y col. (1993). Con el fin de determinar el biotipo de los tres aislados de Y. ruckeri se evaluó la motilidad de los aislados y las características bioquímicas de hidrólisis del Tween 80 y fermentación de sorbitol, así como otros ensayos en que se han informado variabilidad entre diferentes aislados como Voges-Proskauer, rojo de metilo, utilización de citrato e hidrólisis de gelatina, (Stevenson y Daly, 1982). Además, se incluyó el análisis en sistemas miniaturizados API 20E (BioMerieux) y las galerías se incubaron a 25 °C por 48 h.

Adicionalmente, se determinó el serotipo de los aislados, siendo el análisis inmunológico realizado con los antisueros preparados en conejo de las cepas de referencia CECT 955, CECT 956 y CECT 4319T. La relación serológica se realizó empleando la técnica de Dotblot (Cipriano y col., 1985) usando el antígeno somático “O” y los LPS extraídos de acuerdo a Avendaño-Herrera y col. (2004). También se analizó el patrón antigénico de las células completas y LPS en ensayos de Western-blot (Bastardo y col., 2011b). Una reacción similar a la observada con la cepa homóloga indica un resultado positivo. Finalmente, con el fin de confirmar los resultados obtenidos, los ensayos se repitieron usando los antisueros absorbidos.

Con el fin de realizar la caracterización genética de los aislados, se realizó la extracción de ADN de cada Y. ruckeri usando el Kit comercial InstaGene Matrix (Bio-Rad) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Para la caracterización genética se utilizó la técnica de REP-PCR y ERIC-PCR siguiendo el protocolo de Versalovic y col. (1991).

Los resultados bioquímicos y antigénicos se resumen en la Tabla 1. Como se observa, el perfil bioquímico concuerda con los establecidos en numerosos estudios para aislados de Y. ruckeri, pero una característica interesante de los aislados de salmón Coho C-1039, C-1040 y C-1045 estudiados es la ausencia de la capacidad de fermentar sorbitol. Esta incapacidad de fermentar este polialcohol es propia de aislados que pertenecen a un serotipo distinto a O2 (Romalde y col., 2003; Austin y Austin, 2007). Es interesante señalar que las cepas que presentan capacidad motil y actividad lipasa son clasificadas en el biotipo 1 (que incluye los aislados más virulentos), en tanto, las que carecen de ambas capacidades conforman el biotipo 2 (Davies y Frerichs, 1989).

A pesar de los resultados antes señalados, los estudios antigénicos demuestran que los aislados chilenos causante de los brotes corresponden al serotipo O2b, el cual ha sido previamente descrito en Chile, pero en 1 aislado de Y. ruckeri obtenido a partir de salmón Atlántico (Bastardo y col., 2011b). Es muy interesante señalar que los aislados analizados no son consistentes con la propiedad de fermentar sorbitol, por lo que podría ser una característica bioquímica que no está asociada directamente con la virulencia o su participación depende del hospedero.

Finalmente, la caracterización genética usando ERIC-PCR y REP-PCR (Fig. 2) permite observar un patrón idéntico entre los aislados chilenos estudiados, independientemente de la técnica empleada. Sin embargo, al comparar los resultados de todos los ADN analizados con ambas técnicas, el ERIC-PCR permite discriminar entre los patrones de amplificación de acuerdo con el serotipo obtenido. Por lo tanto, existe un patrón común para los aislados chilenos que tiene una mayor similitud con la cepa CECT 956 (serotipo O2b).

En los últimos diez años, se han identificado nuevas cepas de Y. ruckeri, las cuales han sido asociadas con brotes altamente agresivos y señalados como responsables de epizootias en distintas áreas geográficas. Así, en España y EE.UU. estas cepas emergentes de Y. ruckeri carecen de motilidad y han sido clasificadas dentro del serotipo O1 biotipo 2 (Fouz y col., 2006; Arias y col., 2007), mientras que en Inglaterra se han designado como un nuevo biogrupo que representa un grupo clonal diferente (Austin y col., 2003). Otros de estos casos descritos en España (con menor incidencia y tasa de mortalidad) han sido causados por cepas del serotipo O2b (Romalde y col., 2003). Como queda de manifiesto, todavía hay muchos aspectos en Y. ruckeri que precisan atención, desde la aparición de nuevas variedades y determinar si la patogénesis es especieespecífica. Entendiendo la relevancia de realizar estudios que permitan dilucidar éstas y otras preguntas. Recientemente, hemos sometido a evaluación en una prestigiosa revista estos resultados, en la búsqueda de generar conocimiento que sea útil para el desarrollo inmediato de nuevas estrategias de prevención o la mejora de las existentes.

Agradecimientos:

Fondecyt Nº 1150695

Referencias

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