Uso de inóculos congelados en bioensayos de desafío con P. salmonis
Chile: El objetivo del trabajo fue la obtención de protocolos estandarizados para este tipo de experimentos, que contribuyan a mejorar la evaluación de los productos que se desarrollan para combatir las infecciones por esta bacteria, como vacunas, antibióticos, inmunoestimulantes u otros.
Como parte del acuerdo de colaboración entre la revista Salmonexpert y Fundación Chile, celebrado durante este mes, adjuntamos el primer reporte técnico realizado por profesionales de la organización, Aquadvise y Fraunhofer, el cual describe la metodología de preparación y uso de inóculos congelados de P. salmonis , que asegura que sus principales propiedades de concentración y virulencia se mantengan inalteradas durante bioensayos sucesivos.
Resumen
Las infecciones con Piscirickettsia salmonis, el agente causal de la Septicemia Rickettsial Salmonídea (SRS), son un problema permanente en la salmonicultura chilena. Por lo que una importante proporción de los recursos destinados a I+D en esta industria, se destina al desarrollo de productos para la prevención y tratamiento de esta enfermedad. Para todos estos productos, la herramienta experimental obligatoria para su validación final es la medición de la sobrevivencia de los peces en bioensayos de desafío con P. salmonis.
Para el caso de los inóculos, una vez que se ha identificado un aislado de P. salmonis con las características adecuadas de alta virulencia y relevancia para la industria (asociado con brotes recientes), éste tradicionalmente se prepara por crecimiento, ya sea en cultivo en una línea celular de salmones, o en un caldo de cultivo microbiológico. La metodología debe ser lo más estandarizada posible para asegurar la más alta proporción de bacterias vivas, ya que éstas se encuentren en plena fase de crecimiento exponencial y las diferencias de concentración entre los distintos lotes de preparación deben ser mínimas. Esto es crítico, sobre todo cuando el experimento debe hacerse en dos fases.
El objetivo del presente trabajo, que será publicado en la edición número 46 (diciembre) de la revista Salmonexpert, es implementar y validar una metodología de preparación y uso de inóculos congelados de este patógeno, donde se asegure que sus propiedades principales de concentración y virulencia se mantengan inalteradas durante bioensayos sucesivos.
La congelación en alícuotas de una preparación de un inóculo de P. salmonis para su uso directo (después de solo diluir a la concentración requerida) en bioensayos de desafío de salmónidos, demostró ser una herramienta eficaz para disminuir la incertidumbre asociada con la preparación en fresco de los lotes a inyectar. El protocolo estándar que se implementó para la congelación lenta y uniforme de las alícuotas, asegura la conservación en prácticamente un 100% de la viabilidad de las bacterias. Cualquier pérdida de viabilidad es indetectable mediante la titulación en cultivo celular, pero, aunque la hubiere, ésta sería irrelevante para la utilización posterior del inóculo, ya que el tratamiento idéntico de congelación asegura que todas las alícuotas estarán afectadas de la misma manera y tendrán una concentración equivalente de bacterias viables, como se demostró empíricamente.
La utilización de este método, da la confianza de que los inóculos usados en una determinación de DL50 y el ensayo principal que le sigue, son idénticos, independientemente de que los valores de concentración que se obtengan a posteriori en las titulaciones puedan diferir levemente. La misma confianza se puede tener para la comparación de bioensayos independientes, que podrían estar separados en el tiempo por al menos dos años, gracias a la estabilidad temporal de las alícuotas preservadas y a la reproducibilidad de los procedimientos de descongelación y dilución.
El contar con un inóculo estándar que es esencialmente idéntico en cada aplicación y que tiene un comportamiento predecible, es un primer paso fundamental para, posteriormente, poder descubrir y analizar otras fuentes de variación que contribuyen a la incertidumbre en los resultados de los bioensayos de desafío de salmónidos con P. salmonis.
