Variabilidad intraespecífica de Piscirickettsia salmonis en Chile

Por Patricio Feest F.

Piscirickettsia salmonis es el agente etiológico de la Septicemia Rickettsial del Salmón (SRS) o Piscirickettsiosis, enfermedad que afecta la producción del salmón a diferentes latitudes con un particular impacto en el sur de Chile. P. salmonis produce una infección agresiva y sistémica, que implica diversos órganos y tejidos, tales como riñón, bazo, hígado, intestino, cerebro, piel, ovario y branquias, produciendo mortalidades severas en diferentes especies de salmónidos y que representan pérdidas aproximadas de US $ 775 millones por año1 para la industria salmonicultora. Desde la primera descripción de la patología realizada en Chile en el año 1989, la enfermedad ha sido reportada en numerosos países, incluyendo Irlanda, Noruega, Canadá, Estados Unidos, Escocia y Grecia. En Chile, la bacteria es altamente prevalente en el cultivo de salmónidos en fase de agua de mar. A nivel de jaula, al mes de abril del año 2015, la prevalencia es de un 40% y a nivel de centro de cultivo alcanza un 54%. “Aunque afecta las tres principales especies de salmónidos cultivadas en Chile, los mayores impactos se producen en salmón Atlántico y, particularmente, en trucha arcoíris”, explicó el jefe de área de Salud del Intesal, Rolando Ibarra, agregando que “la enfermedad se encuentra presente en la región de Los Lagos, Aysén y, esporádicamente, en la región de Magallanes”. Según Ibarra, los brotes esporádicos en Magallanes estarían relacionados con las condiciones ambientales y productivas de esa zona (temperatura y densidad de centros), lo cual, a su juicio, “hace que la epidemiologia y persistencia de la enfermedad sea muy diferente a la observada en las otras regiones, ya que las medidas de vigilancia y control son las mismas que aplican para el resto de las regiones”. A pesar de la importancia de este patógeno, existe escasa información sobre las bases moleculares de su fisiología y otros aspectos relevantes de su ciclo de vida y patogénesis.

Variabilidad intraespecífica de P. salmonis La prevención y control de SRS no han presentado los resultados esperados en términos de su efectividad, según el representante de Intesal, la prevalencia y las mortalidades debido a SRS permiten establecer que tanto las vacunas como las terapias actualmente disponibles tienen eficacia limitada. En tanto para el director del Laboratorio de Patología de Organismos Acuáticos y Biotecnología Acuícola de la Universidad Andrés Bello (Unab), Rubén Avendaño-Herrera, lo anterior ha desencadenado en el uso excesivo de antibióticos debido, principalmente, al escaso conocimiento del tipo de P. salmonis que se está tratando y al nulo conocimiento de si la bacteria que se está tratando de controlar, es susceptible al antibiótico y a la dosis empleada”. A su vez, otros investigadores han sugerido que estos malos resultados pueden estar asociados con que las cepas de P. salmonis presentan una alta variabilidad intraespecífica y que exhibirían distintos comportamientos de virulencia dependiendo del hospedero, además, manifestarían distintas susceptibilidad a los antibióticos e, incluso, se ha llegado a postular la existencia de una nueva especie bacteriana relacionada con P. salmonis. En este sentido, Avendaño-Herrera expresó que “hoy desconocemos la estructura poblacional de P. salmonis y cuál es la condición silvestre de esta bacteria, es decir, sin haberse enfrentado a ningún antibiótico”. Asimismo, el Jefe de Laboratorio y máster en bioinformática de ADL Diagnostic Chile, Harry Bohle, complementó que “si bien el genoma completo de P. salmonis (cepa LF-89) fue parcialmente descrito en Chile, hasta hoy no hemos podido completar el genoma de P. salmonis, debido a la complejidad, el que está por fuera del estándar de las bacterias comunes (E. coli, Vibrio spp., Pseudomona spp., Yersinia spp., etc.)”. Técnicamente, Bohle explicó que la presencia de un gran número de secuencias repetidas dentro del genoma, algunas de ellas muy grandes, hace muy difícil el ensamblaje de las lecturas obtenidas de los secuenciamientos masivos, agregando que “hasta hoy, nadie ha podido obtener un genoma completo”. “Sin embargo, esto no limita poder analizar la información disponible” aclaró el profesional.

En el año 1999, House y colaboradores2 describieron el grado de virulencia de las cepas aisladas, que en orden decreciente serían la de Chile (LF-89), Canadá (ATL-4-91) y Noruega (NOR-92). Del análisis genético de diferentes aislados, tanto de agua dulce como de mar, y de distintos lugares de origen, se pudo apreciar una homogeneidad genética entre sí, evidenciando además que la cepa LF-89 presentaba un alto porcentaje de mortalidad, siendo identificada como la más virulenta. En cuanto a la variabilidad intraespecífica de P. salmonis, el Dr. Avendaño-Herrera comentó que los primeros estudios que permitieron conocer la estructura poblacional de P. salmonis se remontan al año 1999, cuando Mauel y colaboradores3 analizaron el gen ITS (región intergénica) y describieron la existencia de dos grupos filogenéticos, reconociendo como variantes representativas de cada grupo, las cepas LF-89 (actualmente cepa tipo de la especie) y la cepa EM-90.”Es importante señalar la existencia de otros estudios de genotipificación, sin embargo, al no estar validado por la comunidad científica no me hago parte de ellos, especialmente debido a que en el pasado muchos estudios han quedado en cuestionamiento, incluso la existencia de una nueva especie bacteriana relacionada a P. salmonis” agregó el investigador. Recientemente, estudios realizados por el Instituto de Bioquímica y Microbiología de la Universidad Austral de Chile han encontrado, a través de análisis por 16S e ITS ribosomal, que las cepas de P. Salmonis se distribuyen en cuatro genogrupos, uno con cepas similares a LF-89 y compartido con cepas extranjeras, otro con cepas similares a EM-90 y cepas de otras latitudes, otro con pocas cepas chilenas y un cuarto sólo con cepas sólo extranjeras. En este contexto, el investigador principal del Centro Fondap-Incar, Dr. Jaime Figueroa explicó que han secuenciado diez genomas en un 80% cada uno y no han encontrado diferencias respecto a los genes implicados en resistencia a antibióticos. “Los genes de resistencia presentes en cada genoma son muchos, mas de 100. Por lo tanto, estimamos que no hay correlaciones entre cepas, hospedero y resistencia a antibióticos, no con los datos disponibles hasta ahora”, reveló el investigador. En tanto, “por sus características de poder sobrevivir al interior de macrófagos, hace que el tema del uso de antibióticos no genere la respuesta esperada, además de la alta resistencia que ya posee esta bacteria”, agregó Figueroa.

En este contexto, el director científico de Austral - Omics, Dr. Alejandro Yáñez, quien publicó desde Chile el primer genoma de P. salmonis4, encontró dos genogrupos con indicadores de cepas diferenciadas, en un estudio reciente, donde utilizó la secuenciación del 16S rDNA para analizar 17 cepas chilenas de esta bacteria. Según el investigador, se identificaron dos tipos de genogrupos, uno representado por la cepa tipo LF89 y el otro representado por la cepa EM90, ambas aisladas en Chile. “De acuerdo con el análisis filogenético que realizamos, los genogrupos mostraron homología con cepas noruegas, irlandesas y escocesas”, reveló el investigador, agregando que “esto podría indicar que un alto número de las cepas existentes en la industria acuícola chilena se deriva de estos países probablemente a través de la importación de ovas”. En tanto, en una publicación realizada en año 2014, el equipo de profesionales del laboratorio ADL Diagnostic Chile, dieron a conocer un trabajo donde exponen evidencia científica respecto de las diferencias a nivel genómico entre dos genogrupos de Piscirickettsia salmonis. El estudio, publicado en Genome Announcements5, reportó la secuenciación de los genomas de dos aislados de campo de P. salmonis, recuperados de distintas especies de salmónidos: un aislado similar a LF-89 (B1-32597, salmón Coho) y otro similar a EM-90 (A1-15972, salmón Atlántico). Ambos aislados pertenecen a genogrupos distintos, designados arbitrariamente como genogrupo B (clásico, presente en Chile hace más de 25 años), y otro denominado genogrupo A. “Cuando nos dimos cuenta de que existen dos grupos claramente diferenciados, tuvimos que tomar la decisión de clasificarlos de alguna manera, y los clasificamos como A y B, explicó el autor principal del trabajo, Harry Bohle. “El genogrupo A se diferencia del B en varios aspectos, entre ellos porque es más estacional, se observa con mayor frecuencia en épocas de verano, relacionado con mayores temperaturas, mientras que el genotipo B se observa durante todo el año”, explicó Bohle, añadiendo que “otra de las cosas interesantes que se observan entre estos genogrupos, es que el genogrupo A es altamente susceptible a los antimicrobianos, a diferencia del B, que tiene mayor variabilidad, es decir, hay cepas que son sensibles y resistentes pero, en general, su tendencia es siempre a ser más resistente que lo normal”, reveló el profesional. “Comenzamos a trabajar intensamente con ambos genogrupos. El genogrupo A no tiene mucha variabilidad genética entre sí, no así el genogrupo B, que tiene distintos perfiles de sensibilidad, distintos grados de virulencia y comportamiento clínico” precisó el gerente general de ADL Diagnostic Chile, Patricio Bustos, añadiendo que “gracias a esas características fenotípicas, fuimos secuenciando más genomas. Con eso establecimos un trabajo dentro del genogrupo, lo que nosotros llamamos genovariantes”.”Pudimos separar dentro del genogrupo B cinco genovariantes y cada una de ellas tienen sus propias características y patrones de respuesta a los antibióticos, los cuales hoy podemos diagnosticar por técnicas moleculares (RT-PCR), entregando información objetiva, práctica, rápida y valiosa para las empresas” complementó el ejecutivo.

A su vez, el jefe del Departamento Salud Hidrobiológica del Instituto de Fomento Pesquero (IFOP), Sergio Contreras, explicó que las diferentes clasificaciones carecen de un consenso entre los diferentes grupos de investigación, incluso, opinó “se ha llegado a postular una nueva especie, mientras que otros investigadores insisten que en general, no hay grandes diferencias más allá de las variantes clásicas (genogrupos)”. El IFOP ha caracterizado esta bacteria en peces silvestres y asilvestrados, a través de vigilancia de esta enfermedad entre las regiones de La Araucanía y Magallanes desde el año 2010. “Como grupo de trabajo, hemos detectado a través de microscopia electrónica diferencias de hasta 300% en el tamaño de bacterias de P. salmonis, dentro de un mismo cultivo” reveló Contreras, complementando que “respecto de la forma y el tamaño de la bacteria, creemos más bien que éstas son adaptaciones de la especie, más que variantes propiamente tales”. En tanto, para el director de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile, Dr. Víctor Martínez, existen distintas variantes de P. salmonis, pero también existe escasa información acerca de cómo la bacteria actúa sobre el hospedero, desde un punto de vista molecular. “En mi grupo estamos sometiendo una serie de trabajos asociados a la respuesta transcriptómica en el huésped. Por ejemplo, hemos podido identificar que la bacteria presenta al menos dos vías de captación de hierro. A su vez, se encontró otros genes asociados con factores de virulencia. Por esta razón es importante no sólo conocer las variantes, sino caracterizar la respuesta molecular asociada al proceso de invasión celular llevado a cabo por la bacteria” destacó el investigador. Diferencias en la sensibilidad antimicrobiana El tratamiento contra P. salmonis se basa en el uso de antibióticos; sin embargo, en el último tiempo, la excesiva utilización de estos compuestos ha sido cuestionada tanto por los efectos ambientales y toxicológicos, como por la resistencia y la baja susceptibilidad que presentan estos microorganismos. En este sentido, Sergio Contreras explicó que a través del trabajo de evaluación de la susceptibilidad a antimicrobianos de P. salmonis, por medio de la técnica de CMI (concentración Mínima Inhibitoria), no han detectado variaciones entre genogrupos, ni asociadas al tipo de cuadro clínico, ni respecto del órgano de origen del aislamiento. “En general, se sabe que las variaciones en susceptibilidad bacteriana se evidencian a nivel de poblaciones bacterianas, vinculadas a zonas geográficas extensas y de difícil diferenciación” precisó el investigador.

De acuerdo con estudios realizados por el laboratorio Pathovet sobre la patogénesis y caracterización de la respuesta inmune en post-smolt de salmón Atlántico y utilizando un desafío por cohabitación bajo condiciones controladas frente a dos cepas de P. salmonis (LF-89 y EM-90), han constatado diferencias en la virulencia, tasas de mortalidad acumulada, patrones de mortalidad, patogénesis y patología entre el grupo de peces desafiados con una u otra cepa, tanto en peces troyanos como cohabitantes. “De esta manera, hemos visto que la cepa EM-90, descrita hace dos décadas en salmón Atlántico, es más virulenta, genera una mortalidad más alta y más rápida”, precisó el investigador y gerente general de la empresa, Marco Rozas, agregando que “la cepa EM-90 causa alteraciones rápidas en los indicadores de bioquímica sanguínea y un cuadro patológico similar a LF-89 en hígado y riñón, pero con lesiones cerebrales, en piel y músculo esquelético que no se observaron en peces desafiados con LF-89”. “A pesar de la naturaleza septicémica de la enfermedad, nuestros resultados preliminares desde los desafíos por cohabitación, indicarían que las lesiones patológicas de EM-90 podrían ser consecuencia mayoritariamente de alteraciones hepáticas, mientras que las de LF-89 serían más consecuencia de alternaciones renales” reveló Rozas. No obstante, acotó el investigador “el periodo de incubación y el mecanismo de transmisión pareciera ser muy similar, puesto que la infección y el inicio de la mortalidad de los peces cohabitantes, en ambas cepas, fue muy similar (día 35 a 37 post-desafío IP)”. Asimismo, Marco Rozas agregó que han confirmado diferencias en la expresión de genes asociados con la respuesta inmune innata y adquirida (humoral y celular) entre los grupos de peces desafiados con una u otra cepa y un grupo de peces vacunados (P. salmonis monovalente). “Siempre observamos mayor expresión en peces desafiados con EM-90 respecto de LF-89, sin embargo, los grupos desafiados con las bacterias vivas (especialmente EM-90), siempre presentaron ≥ 3 veces más expresión que los vacunados” reveló el investigador, agregando que “este último hallazgo fundamentaría nuestra idea de evaluar la eficacia de vacunas vivas, mientras se minimicen todos los riesgos que representan la principal desventaja de este tipo de vacunas, es decir, tomar las acciones para controlar la eventual reversión de las bacterias vivas de la vacuna”. Para el Dr. Avendaño-Herrera, aludiendo a estudios realizados en colaboración con el Dr. Alejandro Yáñez, “la bacteria es capaz de adaptarse a los antibióticos cuando se emplean en una concentración sub-letal”. Esto sugiere, explicó el investigador, “que el uso de antibióticos sin un conocimiento previo sobre un aislado está seleccionando P. salmonis más moldeables al contacto de estos compuestos”. Además, agregó que “el desarrollo del diagnóstico molecular para la detección de genes de P. salmonis, nos limita a realizar estudios de susceptibilidad con la bacteria y sus mecanismos de resistencia, los cuales no están determinados por un único gen y, por lo tanto, no es posible diagnosticar cepas resistentes o susceptibles”. Cabe destacar que el grupo del Dr. Yáñez publicó los primeros datos donde se demuestra la capacidad de P. salmonis de adaptarse y evolucionar a cepas más resistentes en respuesta a tratamientos in vitro con antibióticos. Además, este mismo grupo describió el primer medio liquido, denominado Austral-SRS Broth, que permite evaluar las concentraciones mínimas inhibitorias (MIC) de antibióticos en esta bacteria7. “Es muy destacable que el organismo “Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)” líder internacional en el desarrollo y la aplicación de normas de ensayo de laboratorio clínico, reconociera este desarrollo Chileno y determinara que Austral-SRS Broth es el medio estandarizado a usar en MIC” expresó el investigador.

Principales desafíos para mejorar la prevención, el control y tratamiento Dentro de los principales desafíos para mejorar la prevención, el control y los tratamientos de este patógeno, los investigadores concuerdan en que el primer paso es el conocimiento. Más y mejor investigación básica y aplicada. Para Marco Rozas, es necesario incrementar la estandarización y validación de aspectos de la taxonomía del género Piscirickettsia y sus eventuales variantes, además de la genómica funcional de las mismas, particularmente, basado en genomas completos más que el análisis realizado en genes determinados”. En este contexto, Jaime Figueroa concuerda en que hace falta mayor investigación en definir las características de las cepas y tratar de generar comparaciones más integrales, como el uso de análisis de multilocus, agregando que “esto puede dar una respuesta más global, respecto de los genogrupos y sus características”. Mientras que el Dr. Avendaño-Herrera considera importante hacer un llamado a la industria y profundizar en este punto, “ya que la falta de información y/o el mal uso de la existente ha generado un incremento en el uso de antibióticos para controlar la Piscirickettsiosis que ha sido muy contraproducente” dijo el investigador. En tanto, en el IFOP esperan, en el corto plazo, dilucidar las implicancias que tienen los hallazgos de material genético de P. salmonis en los peces no cultivados, en la epidemiologia general de la enfermedad y sus importantes derivadas en las medidas de control y prevención que estos antecedentes conllevan. A su vez, respecto de la evaluación de susceptibilidad, “estamos efectuando en el corto plazo, un ring test con la participación de diferentes laboratorios y grupos de investigación, de forma de aunar criterios respecto de las técnicas y la interpretación de resultados”, reveló Contreras.

En ADL Diagnostic Chile creen que es necesario estandarizar los métodos fenotípicos en Chile, tanto los procedimientos de aislamiento como los de determinación de susceptibilidad a antibióticos. “Hemos trabajado muchos años en esto y, evidentemente, utilizamos nuestros procedimientos, los cuales han sido optimizados año a año y funcionan muy bien” dijo Patricio Bustos, agregando que “estos métodos no son reproducibles en otros laboratorios y, probablemente, esto también ocurra con los procedimientos de otros laboratorios”. “Según nuestra experiencia en P. salmonis, hay múltiples cepas con variaciones importantes, tanto genéticas como fenotípicas y los comportamientos varían más de lo pensado y publicado. Consideramos que tenemos que consensuar puntos de vista, métodos y procedimientos en Chile, pues es una materia de alta complejidad”, expresó el ejecutivo. En este contexto, Marco Rozas dijo que es necesario profundizar el conocimiento respecto de la expresión de factores de virulencia, la patogénesis y la estrategia de la bacteria para evadir el sistema inmune de los peces (foco en el hospedero), de tal manera de mejorar y ampliar la duración de la protección de las vacunas. Mientras que para el profesor Figueroa, sería importante dilucidar si se pueden generar nuevas vacunas usando la información de genomas disponible actualmente. En tanto, en Intesal han desarrollado un trabajo sistemático para identificar las brechas del conocimiento que apunten a construir y diseñar este tipo de herramientas. “Hoy tenemos 60 preguntas en las áreas de epidemiologia, respuesta del hospedador, ecología microbiana, etc. que deben ser respondidas para contribuir, desde el conocimiento, a construir herramientas de control basado en evidencias” dijo Ibarra, agregando que “aunque en el área del diagnóstico y biología molecular existe cada vez mejor información, en las áreas de epidemiologia, patogenia, inmunología, ecología microbiana y terapéutica la información generada y disponible es muy escasa. “Este conocimiento es fundamental para el diseño de herramientas preventivas y de control, como son las vacunas y tratamientos terapéuticos más eficaces” precisó el profesional. En definitiva, el trabajo realizado por diferentes grupos de investigación en Chile, ha permitido obtener un mayor conocimiento acerca de la variabilidad genética de P. salmonis. Es necesario, por lo tanto, unificar esfuerzos en el conocimiento y comprensión de la variabilidad genética intra-específica, para que los futuros avances permitan comprender de mejor forma los procesos asociados con la virulencia, patogenicidad y resistencia a antibióticos. Esto permitirá, sin duda, mejorar las estrategias de prevención y control de esta enfermedad que carcome a la industria.

Notas al pie de página 1 Mardones F. 2014. “Consideraciones Epidemiológicas para el estudio de SRS”. En el marco de difusión final del proyecto Innova-Corfo 12BPC2-13471. 2 House, M., J. Bartholomew J. Winton y J. Fryer. 1999. Relative virulence of three isolates of Piscirickettsia salmonis for Coho salmon Oncorhynchus kisutch. Diseases of Aquatic Organisms 35, 107-113. 3 Mauel, M., S. Giovannoni, J. Fryer. 1999. Phylogenetic analysis of Piscirickettsia salmonis by 16S internal transcribed spacer (ITS) and 23S ribosomal DNA sequencing. Diseases of Aquatic Organisms 35, 115–123. 4 Alejandro J. Yáñez y col. 2014. Draft genome sequence of virulent strain Austral-005 of Piscirickettsia salmonis, the etiological agent of piscirickettsiosis . Genome Announcements 16;2(5). 5 Bohle H., P. Henríquez, H. Grothusen, E. Navas, A. Sandoval, F. Bustamante, P. Bustos, M. Mancilla. 2014. Comparative genome analysis of two isolates of the fish pathogen Piscirickettsia salmonis from different host revealed major differences in virulence-associated secretion system. Genome Announcements 6, e01219-14. 6 Yáñez y col., 2012. Two novel blood-free solid media for the culture of the salmonid pathogen Piscirickettsia salmonis. Journal of Fish Diseases. 7 Alejandro J. Yáñez y col. 2014. Broth micro-dilution protocol for minimum inhibitory concentration (MIC) determinations of the intracellular salmonid pathogen Piscirickettsia salmonis to florfenicol and oxytetracycline”. Journal of Fish Diseases 37, 505–509.