“Pueden inducir decisiones erróneas, como tratamientos antimicrobianos innecesarios”

Un reciente estudio publicado mostró los resultados de un ring test para la detección de Piscirickettsia salmonis mediante qPCR en el que participaron los laboratorios de la red de Sernapesca. La investigación mostró que solo 3 de los 11 laboratorios clasificaron las 14 muestras correctamente como positivas o negativas.

En base a estos resultados, los expertos recomendaron que se considere la posibilidad de armonizar los protocolos de qPCR para reducir la variación inherente asociada con el uso de diferentes protocolos, instrumentos, software, kits, entre otros.

En entrevista con Salmonexpert, la Dra. Andrea Peña, el Dr. Marco Rozas, ambos del Laboratorio Pathovet, y el Dr. Fernando Mardones, de la Pontificia Universidad Católica de Chile, quienes son parte de los autores del estudio, cuentan más detalles al respecto y cuáles podrían ser los pasos a seguir para lograr resultados confiables.

¿Por qué no se ha logrado o planteado utilizar solo un protocolo de PCR para la detección de P. salmonis en todos los laboratorios de la red?

No se plantea como una solución única implementar un protocolo estandarizado para PCR en todos los laboratorios, ya que la diversidad de metodologías puede adaptarse mejor a las necesidades específicas de cada laboratorio. Los ring test realizados a partir del material genético han demostrado buenos resultados entre laboratorios, aun utilizando diferentes primers y sondas y diferentes reactivos y plataformas. El problema que se quiso abordar en el presente ensayo interlaboratorio fue qué sucede con la fase de extracción: ¿se obtendrán los mismos resultados que en los interlaboratorios que parten desde el DNA o RNA? Claramente no fue así y esto va a suceder con cualquier muestra de patógenos que se quiera analizar. 

La extracción de material genético corresponde a una fase preanalítica, en la que es muy importante abordar temas como: evitar la contaminación cruzada, usar un método adecuado de homogenización de los tejidos, utilizar un sistema de extracción adecuado, controles en cada etapa, etc. Si se observan los resultados sobre las muestras de colonias, todos los laboratorios fueron capaces de detectarlas, de la misma forma, todos fueron capaces de detectar las muestras de homogenizado de tejido con carga alta y media y solo tres laboratorios no pudieron detectar las cargas bajas. No obstante, uno de los principales problemas fue que 6 de los 11 laboratorios mostraron amplificación en las muestras de Flavobacterium psychrophylum y/o en los blancos, lo que indica contaminación en estas muestras. Por tanto, lo que en realidad se debe trabajar es en generar protocolos de calidad más rigurosos sobre las condiciones de trabajo de las muestras en cada etapa para minimizar cualquier tipo de contaminación o amplificación inespecífica.

A modo general, ¿cómo catalogan los resultados?

A pesar de que sólo tres laboratorios clasificaron la totalidad de las muestras correctamente, los resultados fueron bastante buenos considerando que era la primera vez que se estaba evaluando la metodología de cada uno durante todo el proceso de un ensayo de detección de un patógeno. Todos los laboratorios fueron capaces de detectar correctamente P. salmonis desde las muestras de colonias, independientemente de la cepa (LF89 o EM90) y también las cargas alta y media de la bacteria en los homogenizados de tejido. Solamente 3 laboratorios tuvieron problemas para detectar las bajas cargas bacterianas. No obstante, la mayor preocupación que demostró el ensayo fue la detección de P. salmonis en los controles negativos.

¿Es preocupante que un 54,5% de los laboratorios tuvieran al menos un resultado falso positivo?

Sí, es preocupante, ya que estos resultados pueden inducir decisiones erróneas, como tratamientos antimicrobianos innecesarios. Los falsos positivos no parecen estar relacionados con los valores de corte del Ct, sino más bien con problemas de contaminación cruzada y ajustes inadecuados en las condiciones del ensayo. Estos hallazgos subrayan la importancia de reforzar la capacitación técnica y las medidas de bioseguridad dentro de los laboratorios.

¿Cómo se pueden mejorar los resultados?

En nuestra experiencia, es importante contar con protocolos que consideren tanto las fases pre-analíticas como las analíticas. Siempre existirá variabilidad asociada a los diferentes equipos, reactivos, primers, sondas, etc, pero lo que se debe evitar es tener desviaciones que impliquen una mala categorización de los resultados, lo que finalmente va de la mano de una adecuada implementación y supervisión de los sistemas de gestión de calidad de cada laboratorio. Creemos que es importante continuar con instancias de conversación entre los laboratorios para poner sobre la mesa problemáticas que puedan estar generándose en cuanto a técnicas de detección de patógenos y desde la experiencia de cada uno, poder gestionar las mejoras correspondientes. Como herramienta, creemos que sería valioso volver a realizar ring tests que consideren desde la extracción hasta los resultados de los PCR/RT-PCR no solo para P. salmonis, sino también para otros patógenos de importancia para nuestra salmonicultura.

¿Cómo contribuyen los resultados al debate sobre la estandarización de protocolos de diagnóstico para P. salmonis considerando investigaciones recientes sobre sensibilidad diagnóstica y estrategias de vigilancia?

Este estudio enfatiza que los problemas en la fase preanalítica, como la contaminación cruzada y la falta de controles rigurosos, son factores críticos que afectan la calidad del diagnóstico molecular de P. salmonis. Este hallazgo es complementado por investigaciones recientes de nuestro grupo multidisciplinario de investigación, como la de Laurin y col. (2020), que valida la qPCR como una técnica sensible y específica para vigilancia y diagnóstico, y la de Delphino y col. (2020), que destaca la eficacia costo-beneficio de estrategias de vigilancia basadas en qPCR para detectar P. salmonis en etapas tempranas. Complementariamente, Rozas-Serri y col. 2023 describieron por primera vez la coinfección con P. salmonis del genogrupo EM90 y LF89 en los mismos tejidos, peces, jaulas y centros de cultivo; lo que soporta la necesidad de mantener un vigilancia epidemiológica no solo de P. salmonis, sino del genogrupo que predomina, ya que el pronóstico de la enfermedad clínica e incluso las concentraciones inhibitorias mínimas para uno y otro genogrupo puede ser significativamente diferente. Adicionalmente, Rozas-Serri y col. 2023 demostraron que 3 de cada 4 diagnósticos de PCR SRS son LF-89 desde 2021 a 2023, lo que generó la interrogante sobre ¿por qué? Bueno, recientemente, Rozas-Serri y col. 2024 demostraron que la estrategia actual de vacunación en Chile basada exclusivamente en aislados EM-90, tienen una protección parcial cuando los peces se desafían con los aislados LF-89.

El trabajo de Price y col. (2020) demostró que la detección temprana mediante vigilancia activa permite a los productores implementar medidas preventivas resultando en una menor mortalidad acumulada y brotes más tardíos en el ciclo productivo. Estos hallazgos subrayan la importancia de diagnósticos confiables y oportunos para maximizar el impacto de la vigilancia activa.

La conexión entre estos estudios es clara: mientras Laurin y col. y Delphino y col. muestran la efectividad de la qPCR y estrategias costo-efectivas para vigilancia, Peña y col. señala los desafíos técnicos en la fase preanalítica que afectan la calidad del diagnóstico. Price y col., por su parte, ilustra los beneficios de detecciones tempranas y oportunas para la gestión de brotes. Juntos, sugieren que un enfoque integral que combine mejoras en protocolos preanalíticos, vigilancia activa y estrategias costo-efectivas es clave para optimizar el control de P. salmonis y minimizar el impacto sanitario y económico de esta enfermedad.

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